甲基丁香酚與什么會產生酸,遠成食品級甲基丁香酚

苯酚

對于苯酚降解的研究，國外起步較早。已經有許多苯酚降解菌株得到了分離和研究。已分離鑒定的微生物包括根瘤菌（rhizobia）、藻類（algaOchromaonas）、酵母菌（Yeasttrichosporon）、醋酸鈣不動桿菌（A.calcoaceticus）、假單胞菌（pseudomonas.Sp)、真養產堿菌（Alcaligeneseutrophus)、反硝化菌（Denitrifyingbacteria）等苯酚降解菌。最常見的酚降解菌是（Pseudomonas）和（Acinetobacter），它們對酚的最大降解濃度一般在1200mg/L以下。沈錫輝等分離到1株能以苯酚、苯甲酸、對甲酚、苯為唯一碳源和能源生長、具有同時降解單環和雙環芳烴能力的細菌菌株，經生理生化、16SrRNA基因序列分析等鑒定為紅球菌PNAN5菌株。在溫度為20～40℃，pH7.0～9.0范圍內該菌株降解苯酚的效率保持在80%～100%之間，苯酚濃度在2～10mmol/L范圍內變化對降解效率沒有明顯的影響。該菌株通過鄰苯二酚1，2—雙加氧酶催化的開環途徑降解芳烴，不同于已知的渾濁紅球菌，后者是通過鄰苯二酚2，3—雙加氧酶催化芳烴降解。探討了初始苯酚濃度、TOC以及酵母生物量間的相互關系。結果表明，苯酚的降解同酵母生長有極大的相關性，初始苯酚濃度升高，抑制酵母生物量增加，轉化率下降;在苯酚的降解過程中，TOC的下降與苯酚同步，苯酚完全降解后TOC主要來自酵母代謝產物。對于初始苯酚質量濃度為559.0mg/L的培養液,降解90%的苯酚可獲得酵母（生物量）328.2mg/L,并可使培養液TOC降解約87.3%。分離出9株好氧降酚顆粒，編號為Ⅰ1-Ⅰ9，經16SrRNA基因序列分析鑒定，包含了醋酸鈣不動桿菌屬、、芽抱桿菌屬，除了Ⅰ3外均表現出高效降酚能力，Ⅰ1和Ⅰ5菌株在苯酚濃度為500mg/L時，與其他菌株相比具有很快的生長速度，Ⅰ2，Ⅰ6和Ⅰ8菌株則表現出很強的聚集能力，并且隨著pH值的升高這種能力減弱，Ⅰ3菌株與其他相比降酚能力低，但是可以增強Ⅰ2和Ⅰ8菌株的聚集能力。在低濃度含氧條件下分離出27株降酚菌，苯酚作為單一碳源和能源，表現出既具有降酚能力同時又具有降低硝酸鹽含量的能力，結果表明好氧降解50μmol苯酚同時有140~200μmol硝酸鹽的減少。從巴西東北部地區的煉油廢水中分離出好氧降酚菌，熱帶假絲酵母菌可以在苯酚濃度為500mg/L或者1000mg/L的環境中生存，并且以苯酚作為唯一碳源，隨著濃度的增加，降解處理所需時間越長，在處理中期菌株釋放出大量的多糖以減弱高濃度苯酚的毒害作用，結果表明這種菌株既具有很強的苯酚降解能力同時可以作為一種表面活性劑，為處理含油廢水提供參考。從工業含酚廢水中分離出來的熱帶假絲酵母菌可以處理濃度為1000mg/L的苯酚，并對其生長進行了動力學分析結果表明,在參數為μmax=0.174/h，KS=11.2mg/L，Ki=298mg/L時生長最佳。從活性污泥中成功分離出一種新的苯酚降解菌EDP3，可以在含有苯酚、、、苯乙酸、苯、乙苯、苯甲醇等的有氧環境中生長，在室溫25°C時可以降解1000mg/L的苯酚。從受紙漿廢水污染的土壤里分離得到假單胞菌MTCC4996可以在156h內降解濃度高達1300mg/L的苯酚廢水，完全降解的pH變化范圍是6.0~7.0，溫度范圍是15~45℃，最佳降解條件是pH為7.0，溫度為37℃，振蕩速率為100~125r/min時完全降解需要66h，而靜止狀態則需要84h，低濃度的葡萄糖和蛋白胨可以提高苯酚處理效果，苯酚的降解速率與添加的金屬離子有關，低濃度的Fe，Cu，Pb，Zn，Mn，Hg可以提高降解速率。在有氧環境中分離出的產堿桿菌P5在有氧氣和硝酸鹽存在的條件下最大降酚濃度為0.29mmol/L，但是在只有氧氣存在的條件下僅有0.16mmol/L。分離出的好氧醋酸鈣不動桿菌，可以高效降解高濃度苯酚，在具有熱敏感性的黏附素蛋白參與下該菌還具有高效的聚集性。在SBR處理系統中連續培養1周，這種降解菌可以固定化成2~3mm的顆粒，具有穩定的屬性并且可以處理200~2000mg/L的苯酚。相應的在VSS中的降酚速率是993.6和519.3mg/d，同時單一的菌株也可以在1500mg/L苯酚濃度下生存，通過共聚焦激光掃描顯微鏡測試顯示，醋酸鈣不動桿菌主要存活在距外表面200~250μm以下，并有胞外聚合物覆蓋以抵抗苯酚的毒性，對聚集進行的分析測試表明有可能是分泌蛋白的作用。

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苯酚降解基因的研究現狀苯酚的降解基因通常成簇排列，位于大質粒上或染色體上。在好氧菌中,苯酚羥化酶基因是降解苯酚的關鍵基因，編碼苯酚降解途徑的第一個酶，負責將苯酚轉化為；將鄰苯二酚開環裂解為三羧酸（TCA）產物，是由鄰位和間位酶負責的。鄰苯二酚的進一步降解具有不同的途徑和酶系統：鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（C23O，間位裂解），或鄰苯二酚1，2-雙加氧酶（CatA，鄰位裂解）。這類雙加氧酶（C23O，CatA），分別由C23O和CatA等雙加氧酶基因編碼,它們在不同的降解菌中具有高度的同源性。從TL3中提取出鄰苯二酚1，2-雙加氧酶，它具有很高的耐酚性和高效的降酚性能。它是由puriWed酶通過硫酸銨沉淀，葡聚糖G-75凝膠Wltration和HiTrapQ瓊脂糖凝膠柱層析得到。最佳生存溫度和pH值分別是25°C和8.0。對底物分析顯示puriWed酶是鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的一種，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的多肽測序片段和MALDI-TOF/TOF總量測定為BLAST分析提供了氨基酸序列信息，BLAST分析結果顯示鄰苯二酚1，2-雙加氧酶與從念珠菌中得到的CaO19_12036蛋白質具有高度的同源性。運用功能性基因分析技術定量評價中的苯酚羥化酶多樣性。首先對實驗室規模的活性污泥中的細菌進行苯酚降解遺傳多樣性的定量分析，用加入苯酚的合成污水喂養首批順式流化床，得到的活性污泥中提取DNA基因組，用于主要亞基苯酚羥化酶（LmPH）基因的保守擴增，并產生克隆庫。經過系統發育分析和9個月的實時PCR分析，LmPH基因拷貝總數基本上仍然穩定，但是在修訂的苯酚污泥中，苯酚降解顯著變化的同時LmPH基因多樣性也50環境保護與循環經濟在增加，這表明活性污泥中苯酚降解效率取決于所結合的一些多余物種的活性。在2001年分離出睪丸酮叢毛單胞降酚菌R5，進一步研究R5降解途徑的苯酚羥化酶基因（Phc），發現與其他的苯酚羥化酶基因具有不同的轉錄調控機制。3個調節蛋白參與了轉錄，其中一個是NtrC家族中常見的積極參與調節其他苯酚羥化酶，另一個抑制Phc的錯亂表達，還有一個對Phc進行擴增表達。這個細致的機制使得降酚菌R5表現出了相對高的苯酚充氧活性，同時也表明降解酶的表達模式也將是多樣化的，并可能影響分解行為。從受苯酚污染的水體里分離出苯酚和甲酚降解假單胞菌，通過苯酚羥化酶（LmPH）和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的序列分析，同時依據質粒傳染pheBA子編碼的鄰苯二酚1，2-雙加氧酶和單組分苯酚羥化酶的結構，在表明物種的菌株和遺傳因子的系統分組菌株之間比較catA基因序列，在由B遺傳因子得到的P.Xuorescens菌株中LmPHs和C23Os相似，而在P.mendocina菌株中遺傳異質性卻很明顯，由遺傳因子C和F得到的P.Xuorescens菌株含有pheBA遺傳操縱子，由遺傳因子B得到的P.putida菌株是通過ortho途徑降解苯酚的，大多數的這種菌株也檢測到這種操縱子，遺傳多樣性的代謝基因結合的結果表明幾乎沒有酚醛化合物降解的中間路線。將S17-1的Tn5轉座子中獲得的自殺性質粒作為載體與具有抗生素耐藥性的供體菌的質粒pAG408融合，在菌株HB101的含有mob基因的質粒pRK600的幫助下，綠色熒光蛋白基因gfp通過細菌交配轉化到受體假單胞菌中，假單胞菌從受苯酚污染的工業廢水中分離得到，可以降解苯酚，這樣就獲得了既可以降解苯酚又同時具有耐藥性的工程菌，在紫外光照射下發出明亮的綠光，這表明將綠色熒光蛋白基因gfp融合到假單胞菌上不會影響它們的降解性能。從煉油廠廢水中分離得到醋酸鈣不動桿菌PHEA-2，在苯酚及苯甲酸的環境中富集馴化培養，研究表明醋酸鈣不動桿菌PHEA-2和NCIB8250的苯酚羥化酶都屬于一個復雜的酶。通過完整的核苷酸序列，進行DNA序列分析表明苯酚羥化酶的編碼基因（mph）及其在醋酸鈣不動桿菌PHEA-2中的下游編碼基因與醋酸鈣不動桿菌NCIB8250中的不同。在醋酸鈣不動桿菌PHEA-2中可能存在mph-ben-cat基因區。

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結論從受污染的環境中分離獲得高效的酚類物質降解菌,研究其降解特性，然后應用到含酚等難降解污染物的廢水處理系統中，是難降解污染物的廢水處理的一條有效途徑，將這些降解菌應用在處理廢水的生物降解反應器、給水設備系統中遭受污染的地方和廢物傾瀉處具有廣泛的應用前景。

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一種從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法與流程

本發明屬于有機化學合成技術領域，尤其是涉及一種從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法。背景技術：香蘭素(又稱香草醛)，是一種廣泛用于食品添加劑或化妝品中的香料，也廣泛用于醫藥中間體，由于其獨特的不能用人工復制的香味，全球每年消耗接近2萬噸，所以又有“香料皇后”之稱。目前香蘭素的生產方法主要有化學合成法、天然產物提取法和生物合成法等，由于化學合成方法過程中會產生污染、制備的產物香氣不純正，因而價格較低，也不能滿足高端市場的需求。從天然植物香莢蘭中提取的香蘭素香氣純正，污染少，受到人們的青睞，但香莢蘭的種植受到地域條件的限制，所以這種方法制備的香蘭素價格高，且產品產量少。生物合成法生產香蘭素雖滿足了一定的市場需求，但是周期長，而且生物酶容易失活，也不能滿足市場的需求。所以探究香蘭素的新的生產方法一直受到人們的關注，其中以丁香酚為原料制備香蘭素就是之一，由于以丁香酚制備的香蘭素香氣純正，因而受到市場的歡迎。同時丁香酚廣泛存在丁香羅勒等植物中，來源廣泛。技術實現要素：針對上述技術問題，本發明的目的在于提供一種從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，從丁香花干花蕾中提取丁香酚，并以丁香酚為原料合成香蘭素。本發明采用的技術方案是：一種從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，包括以下步驟：(1)丁香酚的提取和分離稱取丁香花干燥花蕾，進行水蒸氣蒸餾，直到餾出液清亮，無油珠滴出，則停止加熱，收集餾出液，萃取所述餾出液，得到丁香酚；(2)丁香酚的異構化以三氯化銠為催化劑，通過丁香酚的異構化反應制備異丁香酚；(3)酚羥基的保護將步驟(2)中得到的所述異丁香酚和乙酸酐反應生成異丁香酚乙酸酯；(4)烯鍵的氧化反應用高錳酸鉀對步驟(3)中得到的所述異丁香酚乙酸酯的碳碳雙鍵氧化成醛基，制備香蘭素乙酸酯；(5)香蘭素的制備滴加HCl溶液于步驟(4)中得到的所述香蘭素乙酸酯，直到溶液的pH值顯酸性，在42-50℃水浴溫度下攪拌反應20-30min，冷卻后，用乙醚萃取三次，合并有機相，蒸發掉乙醚，得到香蘭素產品。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，其中，步驟(1)中所述丁香酚的提取和分離，具體為：稱取5-10g丁香花干燥花蕾，研碎后，加入圓底燒瓶中，再加入50ml的蒸餾水，進行水蒸氣蒸餾，中間適當補充水，直到餾出液清亮，無油珠滴出，則停止加熱，收集餾出液；用乙醚萃取所述餾出液，分三次萃取，每次10-15ml，合并有機相，用水浴蒸餾蒸除去乙醚，得到所述丁香酚。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，其中，步驟(2)中所述丁香酚的異構化，具體為：在燒瓶中加入4.2mg的三氯化銠，并加入3滴無水乙醇使其溶解，再加入20.0mmol步驟(1)中得到的所述丁香酚，在140-145℃下回流反應3-5h，反應液逐漸從淡黃色變成亮橙色再變成暗橙色，反應后，停止加熱，冷卻至室溫；抽濾，分離出三氯化銠催化劑，回收；用乙醚萃取濾液中的異丁香酚，合并有機層，水浴蒸去乙醚，得到異丁香酚。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，其中，步驟(3)中所述酚羥基的保護，具體為：在一個干燥圓底燒瓶中加入1.0g的所述異丁香酚，再加入3ml二氯甲烷和0.87ml的三乙胺，得到異丁香酚溶液；在另一個干燥大試管中加入0.58ml的乙酸酐和2ml的二氯甲烷，得到乙酸酐溶液；在冰水浴中將所述乙酸酐溶液緩慢滴加到所述異丁香酚溶液中，在0℃下攪拌反應4-5h，反應結束后溶液變清亮，得到異丁香酚乙酸酯。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，其中，步驟(4)中所述烯鍵的氧化反應，具體為：在圓底燒瓶中加入0.71g的所述異丁香酚乙酸酯，在40-45℃的水浴溫度中將10ml濃度為10wt％的KMnO4溶液緩慢滴加到圓底燒瓶中，保溫反應1.5-2.0h；然后將濃度為20wt％的NaHSO3溶液慢慢加入到燒瓶中，用玻璃棒蘸取試液在濾紙上不顯示紫色，即可停止滴加，得到香蘭素乙酸酯。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，其中，步驟(5)中所述香蘭素的制備，具體為：滴加6mol/L的HCl溶液于步驟(4)中得到的所述香蘭素乙酸酯，直到溶液的pH值顯酸性，在42-50℃水浴溫度下攪拌反應20-30min，冷卻后，用乙醚萃取三次，合并有機相，蒸發掉乙醚，得到香蘭素產品。本發明的反應式如下所示：本發明有益效果：本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，以丁香花干燥花蕾為主要原料，經過蒸餾、萃取、異構化、酚羥基保護、氧化和酸化等步驟得到香蘭素。該方法以天然產物為原料，易得，資源豐富，生產過程容易控制，產物易分離，生產周期快，有廣泛的市場應用前景。丁香酚的異構化反應過程中，不采用傳統的強堿體系中異構化反應，采用RhCl3為催化劑，產率高，無污染，催化劑可分離回收再利用。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，步驟(1)中所述丁香酚的提取和分離具有簡單方便的特點，以水蒸氣蒸餾的方法來帶出產物，不僅大大降低了丁香酚的蒸去溫度，也不會造成污染和副反應。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，步驟(2)中所述丁香酚的異構化，以RhCl3催化異構化和傳統的強堿異構化相比較，不僅該方法的轉化效率高，而且催化劑是固體容易分離。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，步驟(4)中所述烯鍵的氧化反應，與多數工藝相似，這種氧化方法原料廉價易得，操作過程容易控制。本發明所述的從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，步驟(5)中所述香蘭素的制備，此方法制備的香蘭素以天然植物為起始物，原料廣泛易得，所得香氣純正。具體實施方式一種從丁香花中提取丁香酚制備香蘭素的方法，包括以下步驟：(1)丁香酚的提取和分離稱取5g丁香花干燥花蕾，在研缽中研碎后，加入100ml的圓底燒瓶中，再加入50ml的蒸餾水，進行水蒸氣蒸餾，保持沸騰狀態，中間適當補充水，直到餾出液清亮，無油珠滴出，則停止加熱，收集餾出液，；用乙醚萃取所述餾出液，分三次萃取，每次10ml，合并有機相，用水浴蒸餾蒸除去乙醚，得到丁香酚，產率約68％；(2)丁香酚的異構化：通過丁香酚的異構化反應制備異丁香酚在25ml的燒瓶中加入4.2mg的三氯化銠(RhCl3)，并加入大約3滴無水乙醇使其溶解，再加入20.0mmol(3.284g)步驟(1)中得到的所述丁香酚，在140-145℃下回流反應3-5h，反應液逐漸從淡黃色變成亮橙色再變成暗橙色，檢測每一段過程中的反應液，用紫外-可見光譜進行結構分析，反應后，停止加熱，冷卻至室溫；抽濾，分離出三氯化銠催化劑，回收；用乙醚萃取濾液中的異丁香酚，合并有機層，水浴蒸去乙醚，得到異丁香酚，所述異丁香酚的產率大約為99％；(3)酚羥基的保護由于酚羥基的活性大，易被氧化，為避免活潑的酚羥基在碳碳雙鍵被氧化時也被氧化，所以將步驟(2)中得到的所述異丁香酚和乙酸酐反應生成異丁香酚乙酸酯，具體為：在一個10ml的干燥圓底燒瓶中加入1.0g的所述異丁香酚，再加入3ml二氯甲烷和0.87ml的三乙胺，得到異丁香酚溶液；在另一個干燥大試管中加入0.58ml的乙酸酐和2ml的二氯甲烷，得到乙酸酐溶液；在冰水浴中將所述乙酸酐溶液緩慢滴加到所述異丁香酚溶液中，在0℃下攪拌反應4h，反應結束后溶液變清亮，得到異丁香酚乙酸酯，低溫保存所述異丁香酚乙酸酯；(4)烯鍵的氧化反應用高錳酸鉀對步驟(3)中得到的所述異丁香酚乙酸酯的碳碳雙鍵氧化成醛基，制備香蘭素乙酸酯；具體為：在100ml的圓底燒瓶中加入0.71g的所述異丁香酚乙酸酯，在40℃的水浴溫度中將10ml濃度為10wt％的KMnO4溶液緩慢滴加到圓底燒瓶中，維持40℃的溫度反應1.5h；然后將濃度為20wt％的NaHSO3溶液慢慢加入到燒瓶中，用玻璃棒蘸取試液在濾紙上不顯示紫色，即可停止滴加，得到香蘭素乙酸酯；(5)香蘭素的制備滴加6mol/L的HCl溶液于步驟(4)中得到的所述香蘭素乙酸酯，直到溶液的pH值顯酸性，在45℃水浴溫度下攪拌反應20min，冷卻后，用乙醚萃取三次，合并有機相，蒸發掉乙醚，得到香蘭素產品。以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護范圍內。

HPLC對細辛含藥血清中甲基丁香酚和馬兜鈴酸A含量的測定

HPLC對細辛含藥血清中甲基丁香酚和馬兜鈴酸A含量的測定

目的用高效液相色譜法(HPLC)對細辛含藥血清中甲基丁香酚和馬兜鈴酸A(AAI)的含量進行測定,旨在為臨床安全有效地使用細辛和客觀評價細辛提供實驗依據,并建立起測定細辛含藥血清中甲基丁香酚和AAI的含量的HPLC方法。方法1細辛含藥血清的制備將北細辛根莖置于電熱干燥箱中干燥1h(溫度40℃),然后經球磨粉碎機研磨粉碎,過5號篩(80目),即得細辛散劑,置于陰涼處密封保存備用。將成年SD大鼠隨機分成兩組,即空白血清組和含藥血清組。其中細辛含藥血清組的細辛用藥劑量為1.78g/kg;空白血清組給予等量的生理鹽水。每天給藥2次,連續8天。在最后一次給藥2h后對大鼠進行眼眶采血。將所采血液在室溫下靜置30min后取上清液,3000rpm離心20min,分離血清,取血清2ml,滴加甲醇8ml,混勻,2500rpm離心10min,取上清液,水浴65℃揮去甲醇,余液濃縮,過0.22μm微孔濾膜濾過除菌,分裝,-20℃條件下保存備用。2HPLC對細辛含藥血清中甲基丁香酚含量的測定用HPLC法,儀器為戴安高效液相色譜儀：P680型輸液泵、在線脫水機、手動進樣器、TCC-100柱溫箱、PDA-100二極管陣列檢測器、chromeleon色譜工作站。條件：色譜柱為DiamonTMODS-C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-水-0.025mol/1磷酸(78：21：1);柱溫為室溫;檢測波長為250nm;流速為1ml/min;進樣20μl,測定細辛含藥血清中甲基丁香酚的含量。3HPLC對細辛含藥血清中AAⅠ含量的測定用HPLC法,儀器為戴安高效液相色譜儀：P680型輸液泵、在線脫水機、手動進樣器、TCC-100柱溫箱、PDA-100二極管陣列檢測器、chromeleon色譜工作站。條件：色譜柱為DiamonTMODS-C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-水-醋酸(72：27：1);柱溫為室溫;檢測波長為390nm;流速為1ml/min;進樣20μl,測定細辛含藥血清中AAⅠ的含量。結果細辛含藥血清中甲基丁香酚的含量為0.0032mg/ml。細辛含藥血清中AAⅠ的含量低于檢測限。結論1初步開展了HPLC法對細辛含藥血清中甲基丁香酚和AAⅠ的含量測定;2建立了測定細辛含藥血清中甲基丁香酚和AAⅠ的HPLC方法;3細辛含藥血清中含有一定血藥濃度的甲基丁香酚,不含AAⅠ?！?/p>